實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（Real Time Quantitative PCR）

在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，zui后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。

相對(duì)定量應(yīng)用（Relative Quantification，RQ）    

 特異性熒光標(biāo)記：

 TaqMan法

 TaqMan探針的特性：

（1）5′端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)（Reporter, R），如FAM、VIC等

（2）3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán) （Quencher, Q）

（3）探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收 ，無(wú)熒光， R與Q分開(kāi)，發(fā)熒光

（4）Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針

相對(duì)定量通過(guò)內(nèi)標(biāo)定量：
內(nèi)標(biāo)（Endogenous Control）通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因，在細(xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素影響小，內(nèi)標(biāo)定量結(jié)果代表了樣本中所含細(xì)胞或基因組數(shù)量。

相對(duì)定量分析方法  ：

 2-ΔΔCt
前提：目標(biāo)序列和內(nèi)參序列的擴(kuò)增效率接近100％且偏差在5％以內(nèi)
  1、用內(nèi)參基因的CT值歸一目標(biāo)基因的CT值：
    ΔCT（test）= CT（target,test）-CT（ref,test） 
    ΔCT（calibrator）= CT（target,calibrator）-CT（ref, calibrator） 
  2、用校準(zhǔn)樣本的ΔCT值歸一試驗(yàn)樣本的ΔCT值：
         ΔΔCT= ΔCT（test） - ΔCT（calibrator）
  3、計(jì)算表達(dá)水平比率：
                    2 –ΔΔCT=表達(dá)量的比值

服務(wù)流程：

注意：客戶可根據(jù)所能提供的起始材料不同，選擇從步驟1或2啟動(dòng)項(xiàng)目。